我院陈翊平教授团队在Nature Communications发表高水平文章
近日，大连工业大学食品交叉科学研究院陈翊平教授团队在TOP学术期刊Nature Communications （5-year IF : 17.2，自然指数期刊）发表题为“Activation Mechanism and Integrated One-Pot Assay of Chiral-like crRNA-Enhanced CRISPR/Cas12a Systems”的研究论文，博士研究生李永辉为第一作者，陈翊平教授为唯一通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金项目（No. 32172293和32572677）的资助。
研究背景
海产品中食源性致病菌的准确简便检测对于保障海产品质量安全具有重要的意义。CRISPR/Cas12a系统作为一种由单一crRNA引导、兼具RNase和DNase双重活性的V型效应蛋白，已从原核生物天然的噬菌体防御机制发展为分子诊断领域的核心工具。在该系统中，Cas12a首先通过其RNase活性切割前体crRNA（pre-crRNA）的重复序列，释放出14–17 nt的5′重复片段，同时剩余部分折叠为茎环结构形成成熟crRNA，后者进而引导Cas12a执行靶向DNA切割。目前，pre-crRNA成熟过程中释放的5′重复片段是否具有独特的功能意义，至今仍是一个未被充分探索的关键科学问题。为提升检测灵敏度，对靶标进行扩增是常见的增敏手段。然而，扩增体系与CRISPR-Cas12a检测体系之间存在天然的不兼容性，难以在单管中实现高效反应，这严重阻碍了其在现场快速检测中的部署。因此，开发新型一锅法检测策略，以兼容扩增与Cas12a切割反应，成为提升Cas12a介导的核酸检测方法便捷性与实用性的重要研究方向。
成果介绍
本研究发现，工程化的5'-重复片段能够有效激活Cas12a的切割活性，其切割效率强烈依赖于3'-间隔区的序列长度。值得注意的是，当3'-间隔区完全截短时，会形成一种“类手性crRNA”构象，从而引导出一种延迟切换模式的Cas12a激活机制，这与传统的成熟crRNA截然不同。基于这一特性，本研究开发了一种基于延迟切割特征的一锅法传感策略，以应对长期以来基于Cas12a的切割反应与核酸扩增不相容的难题，其灵敏度相较于传统的成熟crRNA介导的一锅法提升了1,000倍。此外，我们将基于切割的一锅法检测与便携式温控荧光成像设备整合，构建了一个用于高通量筛查的现场诊断平台，为保障海产品质量安全提供有力保障。本研究进一步深化了对crRNA引导机制的理解，并推动了其在基因编辑和分子诊断领域应用范围的拓展。
图文赏析
图1 类手性crRNA激活CRISPR/Cas12a系统的机制及其在一锅法检测中的应用
基于CRISPR/Cas12a系统，针对海产品中食源性致病菌检测需求，探究pre-crRNA成熟过程中释放的5′端重复片段的未知功能，并开发新型一锅法检测策略，以解决扩增体系与Cas12a切割反应在单管中不兼容的问题，从而提升现场快速检测的灵敏度与便捷性。
图2 类手性crRNA引导的Cas12a体系的切割性能探究
工程化pre-crRNA 5′端重复片段可激活Cas12a体系的侧切活性，其活性强度受到3′端序列的调控。当3′端序列缩短至0 nt时，所形成的类手性crRNA表现出和传统成熟crRNA一致的切割活性，但表现出独特的切割机制。
图3 类手性crRNA引导机制探究
类手性crRNA引导Cas12a体系RNase活性的激活是DNase活性激活的先决条件。类手性crRNA首先与Cas12a酶结合，并激活其RNase活性释放5′端重复片段，随后自发组装到3′端以激活Cas12a酶的DNase活性。
图4 类手性crRNA引导的Cas12a体系切割特性分析
类手性crRNA引导的Cas12a体系展现出独特的延迟切割性能。分子动力学结果显示，与传统成熟crRNA引导体系相比，类手性crRNA与Cas12a酶展现出一致的结合位点和结合强度。此外，类手性crRNA对靶标长度具有一定的偏好性，需长于36 nt的ssDNA才能显著激活切割活性。
图5 “延迟切割”特性介导的一锅法Cas12a检测技术
类手性crRNA引导的Cas12a酶体系所展现出的延迟切割特性完美打破了扩增体系和切割体系之间的不平衡，所产生的10-15分钟的低活性期使得RPA扩增得以顺利进行，灵敏度提升1000倍，并在不同靶标之间展现出优异的通用性。
图6 DFTFD平台的性能验证
将构建的新型一锅法检测策略集成至自主搭建的便携式恒温荧光成像一体化设备，构建了用于即时检测的DFTFD平台。该平台在筛查海产品实际样本时与qPCR方法达到了100%的一致性，同时具有更低的成本、更短的检测周期和更高的便携性。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-71675-7
